LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA PERCOBAAN KE V PEMURNIAN PROTEIN
I.
TUJUAN
PERCOBAAN
Memahami metode pembuatan whey
protein dari susu sapi dan pemurnian
II.
PRINSIP
PERCOBAAN
-
Teknik pembuatan whey
yang kaya akan protein murni melalui proses salting out dan pemurnian
-
Teknik pemurnian
ekstrak kasar dengan presipitasi protein oleh ammonium sulfat karena terjadi
“salting out”
-
Kromatografi filtrasi
gel, pemisahan protein dari ammonium sulfat dan senyawa lainnya berdasarkan
perbedaan ukuran
-
Kromatografi afinitas,
pemurnian protein berdasarkan reaksi spesifik antara protein-ligan
III.
LANDASAN
TEORI
Pemurnian
Protein
Untuk
memproduksi enzim dalam jumlah besar dan mempunyai aktivitas yang tinggi, perlu
diperhatikan faktor faktor pentin seperti kondisi pertumbuhan, cara isolasi,
serta jenis substrat yang digunakan (Wang, 1979).
Tahapan
pemurnian protein adalah sebagi berikut:
1. Ekstraksi
Ekstraksi
Metode ekstraksi enzim ditentukan oleh
jenis sumbernya. Enzim yang terdapat pada tepung biji-bijian diekstraksi dengan
cara mencampur pada media cair kemudian diaduk. Enzim dari bagian tanaman yang
bersifat lunak diekstraksi dengan dipotong kecil kecil, diproses kemudian
disaring dengan kain, sedangkan untuk mengekstrak enzim dari daun dan
biji-bijian atau danging dengan cara digiling, dihomogenasi dalam media cair
atau langsung di blender dalam media caie. Dalam ekstraksi enzim dari tanaman
atau daging menggunakan buffer untuk mempertahankan harga pH. (Joseph, at all,
1994)
IV.
ALAT
BAHAN
ALAT
|
BAHAN
|
Blender
|
Ammunium sulfat (padat)
|
Kain penyaring
|
Daging dada ayam
|
Pipet tip
|
Dapar pengekstrasi yang terdiri dari:
o
10mM Tris-HCl (pH 7,4)
o
1mM 2-Mercaptoethanol
o
1mM Phenylmethylsulfonyl fluroridem
(PMSF)
o
1mM Ethylenediamine tetraacetic acid
(EDTA)
|
Tabung mikrosentrifugasi
|
|
Tabung sentrifuasi 50mL
|
V.
PROSEDUR
KERJA
Penyimpan
jaringan, dada ayam seberat 50 g dipotong dan dicatat beratnya dengan teliti.
Kemudian dipotong kecil-kecil, jaringan ikat dan jaringan lemak yang ada pada
dada ayam dibuang.
Ekstraksi
protein yang larut, potongan dada ayam dan 75mL dapar pengekstraksi dingin
dimasukan ke dalam blender, ditutup dan jaringan dihancurkan dengan homogenasi.
Kemudian, blender dinyalakan 4x30 detik dengan jeda 10 detik untuk menurunkan
temperatur homogenate.
Sentrifugasi,
homogenate yang telah didinginkan dimasukan kedalam empat tabung sentrifugasi
sebanyak 50mL, perlu dipastikan tube tidak terlalu penuh. Kemudian, dimasukan
kedalam sentrifugasi (diseimbangkan dengan cara memastikan setiap tabung yang
bersebrangan beratnya sama). Sentrifuga
adalah alat yang berbahaya dan mahal, saat menggunakannya harus dibawah
pengawasan asisten laboratorium. Sentrifuga dinyalakan selama 20 menit pada
150.000 rpm.
Filtrasi, supernatant
(cairannya) dituangkan melalui kain penyaring kedalam gelas kimia yang sudah
didinginkan terlebih dahulu. Ampas daging ayam dibuang ke tempat yang telah
disediakan. Diukur dan dicatat volume
supernatant, kemudian disimpan 3x0,5 mL aliquot (tandai dengan tulisan
homogenate kasar).
Presipitasi
dengan Ammonium sulfat, secara perlahan (lebih dari ~15menit) ditambahkan 0,39
grams ammonium sulfat per mL per supernatant ke dalam supernatant yang telah
disaring sambil diaduk. Pekerjaan tahap ini dilakukan pada suhu dingin dan
pengadukan dilakukan dengan pengaduk magnet. (lihat gambar dibawah ini).
Pengadukan dilakukan perlahan agar tidak terjadi denaturasi protein (jika
terbentuk busa, menunjukan bahwa protein telah terdenaturasi). Diaduk lagi
selama 15 menit setelah selesai ditambahkan ammonium sulfat agar tercapai
kesetimbangan.
Sentrifugasi- sampel
disentrifugasi dengan prosedur yang sama dengan diatas. Supernatant dan pellet
disimpan ditempat yang berbeda dan disimpan di lemari es untuk tahap pemurnian
selanjutnya. LDH seharusnya terkandung dalam pellet.
VI.
DATA
PENGAMATAN DAN PERHITUNGAN
6.1.
DATA PENGAMATAN
No
|
Pengamatan
|
Keterangan
|
||||
1
|
Penyiapan jaringan
|
Dada ayam 50g
dipotong kecil - kecil dan dibuang jaringan ikat dan lemaknya
Dapar pengkesktraksi yang telah dibekukan yang
selanjutnya akan dihaluskan menjadi butiran dapar pengekstraksi yang lebih
kecil
|
||||
2
|
Ekstraksi protein yang larut
|
Potongan dada
ayam dan dapar pengekstraksi yang akan dihaluskan dengan blender berwarna krem
Potongan dada
ayam dan dapar pengekstraksi yang telah dihaluskan dengan blender selama 4x
30 detik dan jeda 10 detik
menghasilkan suatu pasta yang berwarna krem
|
||||
3
|
Sentrifugasi
|
Pasta campuran
dada ayam dan dapar pengekstraksi dimasukan pada 4 tabung sentrifugasi
kemudian dimasukan pada sentifugasi secara bersebrangan
|
||||
4
|
Filtrasi
|
Setelah
disentrifugasi terdapat 2 lapisan pada tabung sentrifugasi. Lapisan atas
adalah supernatant yang berwarna kuning bening dan lapisan bawah merupakan
pellet yang berwarna krem
Supernatant yang telah dipisahkan dengan pellet
dimasukan pada gelas ukur dan diperoleh bahwa supernatant yang dihasilkan
sebanyak 6,8mL
|
||||
5
|
Presipitasi dengan amonium sulfat
|
Ketika
supernatant ditambahkan dengan ammonium sulfat dan diaduk dengan magnetik
stirer warna supernatant menjadi berwarna krem
|
||||
6
|
Sentrifugasi
|
Setelah
dilakukan sentrifugasi kembali, terdapat 2 lapisan pada tabung sentrifugasi.
Lapisan atas berupa supernatant yang berwarna kuning bening dan pellet yang
berwarna krem
|
6.2.
PERHITUNGAN
Preparasi
Amonium sulfat yang diperlukan =
amonium sulfat permL per supernatant –
volume supernatant
Amonium sulfat yang diperlukan = 0,35 gram/mL x 6,8 mL
Amonium sulfat yang diperlukan = 2,65 gram
0 comments